Characterization of GAR22 function in the regulation of red blood cell differentiation and cell migration

• Charakterisierung der Funktion von GAR22 in der Regulierung der erythroiden Differenzierung und Zellmigration

Gamper, Ivonne; Zenke, Martin (Thesis advisor)

Aachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University (2009)
Doktorarbeit

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2009

Kurzfassung

Thyroxin-Rezeptoren (TR) sind liganden-abhängige Transkriptionsfaktoren, die die Erythropoese beeinflussen. In dieser Arbeit wurde die TR-Aktivität in erythroiden Zellen mittels genomweiter Genexpressionsanalysen bestimmt. Der durch Thyroxin (T3) aktivierte TR beschleunigt die Differenzierung von erythroiden Vorläuferzellen und inhibierte die Proliferation dieser Zellen. Daher wurden erythroide Vorläuferzellen mit Erythropoietin (Epo) und Insulin in vitro mit und ohne T3 differenziert. Der Vergleich dieser beiden Expressionsprofile zeigte, dass Gene, die zur Differenzierung beitragen, schneller reguliert wurden, wenn die Zellen mit T3 behandelt wurden; hierzu zählen GATA-2, c-kit und Band 3. Darüber hinaus wurden Gene reguliert, denen bisher noch keine bekannte Funktion während der erythroiden Differenzierung zugeschrieben werden konnte. Dazu gehören BTEB1 ("basic transcription factor 1/Krüppel-like factor 9") und GAR22 ("growth arrest specific gene 2 on chromosome 22"). Darüber hinaus wurde gefunden, dass die Expression des GAR22-Gens direkt durch TR reguliert wird. GAR22 wurde ursprünglich als potenzielles Tumorsuppressor-Gen identifiziert und kann somit Zellproliferation und Zellzyklus beeinflussen. In dieser Arbeit konnte ich zeigen, dass GAR22 den Zellzyklus von erythroiden Vorläuferzellen verlängert, aber keinen Einfluss auf die Expression von erythroiden Genen hat. GAR22 bindet an die Cytoskelett-Strukturen der Mirkotubuli und Mikrofilamente. GAR22 könnte daher eine Rolle bei den Veränderungen des Cytoskeletts spielen, welche während der erythroiden Zelldifferenzierung ablaufen. Um die Rolle von GAR22 im Cytoskelett näher zu untersuchen, wurden verschiedene Grün-Fluoreszenz-Protein (GFP)-gekopplete GAR22-Fusionsproteine generiert. Die Lokalisierung und Dynamik von GAR22 wurde anschließend in B16F1 Mausmelanoma-Zellen und NIH3T3 Fibroblasten beobachtet. Diese Zellen sind aufgrund ihrer flachen und adhärenten Morphologie sowie ihrer ausgeprägter Mobilität ein geeignetes experimentelles System, um das Cytoskelett und die Zellmigration zu studieren. GAR22 wird von der Zelle in zwei Speißvarianten generiert: GAR22alpha und GAR22beta. Beide GAR22 Varianten binden an Aktin und folgen der Dynamik von Aktin, was darauf hinweist, dass GAR22 an der Regulation des Aktin-Cytoskeletts und der Zellmigration beteiligt sein könnte. Diese Hypothese konnte mit der Beobachtung bestätigt werden, dass GAR22beta überexprimierende Zellen in der gerichteten Zellbewegung eingeschränkt sind. Um die Funktion von GAR22 weiter zu charakterisieren, wurde mittels Proteomiktechnologien und Massenspektrometrie GAR22-bindende Proteine gesucht. Dies führte zu der Identifikation von EB1 ("end binding protein 1") als neuer Interaktionspartner von GAR22beta. Diese Bindung wird über den Carboxy-terminalen Teil von GAR22beta vermittelt. EB1 bindet an die Plus-Enden der Mikrotubuli, wodurch es die Dynamik und Stabilität der Mikrotubuli reguliert. Die Interaktion von GAR22beta und EB1 könnte die Mikrotubulidynamik beeinflussen. Diese Annahme wird durch die Beobachtung unterstützt, dass in GAR22beta exprimierenden Zellen, EB1 nicht mehr an den Plus-Enden der Mikrotubuli lokalisiert ist. Das geht mit dem Zusammenbruch der Mikrotubulistruktur einher. Desweiteren sind diese Zellen nicht in der Lage, ihr Mikrotubuli-Cytoskelett im selben Zeitrahmen wiederherzustellen wie nicht-transfizierte Kontrollzellen. Um die Bedeutung der Interaktion von GAR22beta mit Mikrofilamenten und Mikrotubuli weiter zu untersuchen, wurden die Aktin-Bindedomäne oder die Mikrotubuli-Bindedomäne von GAR22beta jeweils selektiv deletiert. Zellen, die eine der beiden Mutanten überexprimierten, zeigten eine erhöhte Zellmigration, im Gegensatz zu Zellen, die das nicht-mutierte GAR22beta exprimierten. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass GAR22beta die gerichtete Zellbewegung durch die Regulation der EB1-Mikrotubuli Bindung, beeinflusst. Durch die duale Bindung von GAR22 an Mikrofilamenten und Mikrotubuli kann GAR22beta das funktionelle Zusammenspiel der beiden Cytoskelette regulieren. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die Aktivität von GAR22beta in der Zellbewegung von entscheidender Rolle ist und die Funktion von GAR22beta über die in der Erythropoese hinausgeht.

Einrichtungen

• [811001-1]