Towards the generation of recombinant and pharmaceutically relevant target proteins : phage display based isolation of specific scFv antibodies against metastasizing pancreatic carcinoma for clinical application and development of novel fluorescent reporter tags for on-line monitoring during target protein production

• Über die Generierung rekombinanter und pharmazeutisch relevanter Zielproteine : die Phage-Display-basierte Isolierung spezifischer scFv-Antikörper zur klinischen Anwendung gegen das metastasierende Pankreaskarzinom und die Entwicklung eines neuartigen fluoreszierenden Reportertags zum Online-Monitoring der Produktion eines Zielproteins

Siepert, Eva-Maria; Barth, Stefan (Thesis advisor)

Aachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University (2013, 2014)
Doktorarbeit

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2013

Kurzfassung

Das Pankreaskarzinom (PK) ist eine aggressive Krebsart, die sich durch ihr hohes Potential zur Metastasierung sowie eine schlechte Prognose auszeichnet. Ein asymptotischer Verlauf im Frühstadium, sowie der Mangel an verlässlichen Diagnostika, verhindern oft eine Früherkennung vor der Tumorinvasion in das lokale Gewebe. Die operative Tumorentfernung, kombiniert mit dem Erstlinienchemotherapeutikum Gemcitabin und Strahlentherapie, stellen nur lebensverlängernde Maßnahmen dar. Aufgrund der hohen Resistenz gegen konventionelle Therapeutika und dem enormen Potential zur Metastasierung bleiben minimale Mikrometastasen zurück, die für eine äußerst hohe Rückfallrate verantwortlich sind. Im ersten Teil dieser Thesis stand daher die Entwicklung neuer tumorspezifischer single-chain Antikörperfragmente (scFv) im Vordergrund, die in zukünftigen Anwendungen sowohl als zytolytisches Therapeutikum in der adjuvanten Therapie des metastasierenden PKs, als auch in der molekularen Frühdiagnose Einsatz finden sollen. Mittels der Phage-Display-Technologie wurden aus den naiven humanen Tomlinsonbibliotheken I und J pankreasspezifische scFv-Phagen-Antikörper gegen unbekannte tumorassoziierte Antigene generiert. Diese hochspezifischen scFv-Phagen-Liganden wurden über eine zweistufige Panningstrategie isoliert, die aus einer Depletion auf humanen periphären mononuklearen Blutzellen mit anschließender Positivselektion auf der metastasierenden Pankreaskarzinomzelllinie L3.6pl bestand. Mittels monoklonalem Phagen-ELISA wurden 16 einzigartige L3.6pl-Binder identifiziert, und im Anschluss im eukaryotischen HEK293T-Expressionsystem als lösliche scFv-SNAP-tag Fusionsproteine hergestellt. Zusätzlich wurde der Klon 14.1(scFv)-SNAP, isoliert aus einer laboreigenen murinen immunisierten Phagenbibliothek, in den Expression- und Charakterisierungsprozess integriert. Die Bindespezifität und Kreuzreaktivität von neun IMAC-gereinigten scFv-SNAP Proteinen wurde mittels eines löslichen Protein-ELISAs und der Durchflußzytometrie analysiert. Bei vier dieser Klone konnte im OPERA-System überdies eine Internalisierung nachgewiesen werden. Alle positiven Kandidaten sind klinisch relevante pankreasspezifische scFvs mit Potential zur zielgerichteten Eliminierung residualer Krebszellen und Therapie, sowie vielversprechend im Hinblick auf die in-vivo-Diagnostik und Theranostik. Für die Produktion von rekombinanten pharmazeutischen Proteinen im Großmaßstab wurden hocheffiziente Screeningmethoden entwickelt, um die optimalen Kultivierungsbedingungen für bakterielles Wachstum und Produktformierung zu charakterisieren. Mikrotiterplatten (MTPs), in Kombination mit Messystemen wie dem BioLector®, dienen im Labormaßstab zur nicht invasiven Online-Dokumentation der Produktformierung von kontinuierlich geschüttelten mikrobiellen Kulturen. Konventionelle Reporterproteine für die Online-Messung, z.B. GFP und seine Derivate oder Flavinmononukleotid-basierte fluoreszierende Proteine, besitzen ein hohes Molekulargewicht welches den Wirtsorganismus negativ beeinflusst. Zusätzlich ist die Reifung der Fluorophore von GFP in hohem Maße abhängig von der Sauerstoffsättigung. Aufgrund der Nachteile der konventionellen Reporterproteine, wurden im zweiten Teil dieser Arbeit kurze optisch aktive Reportertags zur Online-Detektion entwickelt. Diese neuartigen Reportertags (W-tags) basieren auf der Autofluoreszenz der aromatischen Aminosäure Tryptophan. Mittels in silico-Modellierung wurden zwischen ein und fünf Tryptophanreste in die natürlich vorkommende Proteinschleife des Cold Shock Proteins (Bc Csp) integriert, so dass die ausgeglichene Ladung der Tryptophanreste auf der Außenseite präsentiert wurde. Alle fünf W-tags wurden genetisch an die Antikörperfragmente anti-CD-30 Ki-4(scFv) und anti-MucI M12(scFv) fusioniert, und im prokaryotischen pMT-Expressionssystem produziert. Die Produktfluoreszenz wurde während der Fermentation in MTPs online vermessen, gefolgt von einer Bindeanalyse im Durchflußzytometer. Die Tryptophanfluoreszenz nahm dabei entsprechend der Produktformierung zu, wobei für eine höhere Anzahl an Tryptopharesten ein stärkeres Signal gemessen wurde. Für die Konstrukte mit W1-W3 war eine Rückgewinnung möglich, während W4 und W5 aufgrund der hohen Hydrophobizität der akkumulierten Trytophanreste im Zellpellet verblieben. Mittels normaler und komparativer Durchflußzytometrie der W-tag Fusionsproteine auf L540cy-Zellen wurde die Bindespezifität der Konstrukte bestätigt, welche nicht beeinflusst wurde, obwohl W-tags mit mehr als einem Trytophanrest einen negativen Einfluss auf die Bindeaktivität und -affinität zeigten. Die neuen W-tags stellen eine verwendbare Alternative zur nicht invasiven Produktdokumentation von rekombinanten Proteinen dar, ohne die Nachteile der konventionellen Reporterproteine. Sie bieten die Möglichkeit für eine schnelle und qualitative Onlinemessung während der Produktion von pharmazeutisch relevanten Zielproteinen im Großmaßstab.

Einrichtungen

• [811001-1]