Fluorescent Ghosts

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Johanna Clauser

Oberingenieurin Research & Validation

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Hintergrund

Künstliche Herz-Kreislauf-Unterstützungssysteme, wie zum Beispiel Blutpumpen oder Herzklappen, finden vielfältigen Einsatz in der Therapie kardiovaskulärer Krankheiten. Trotz immerwährendem Fortschritt in der Entwicklung ist die Anwendung häufig mit schwerwiegenden Komplikationen, wie der vermehrten Zerstörung von roten Blutkörperchen, der Hämolyse, verbunden.
Während der Hämolyse tritt der rote Blutfarbstoff, das Hämoglobin, ins Blutplasma aus und kann so nicht mehr zum lebenswichtigen Sauerstofftransport beitragen. Die Minimierung der Hämolyse ist daher ein Kernziel der Entwicklung blutführender Medizinprodukte.
Zur Untersuchung der Strömung in blutführenden Medizinprodukten werden Methoden der optischen Strömungsanalyse, wie zum Beispiel die Particle Image Velocimetry (PIV) mit einer Blutersatzflüssigkeit angewendet.
Bei normgerechten In-vitro-Versuchen wird Blut als Testmedium verwendet. Diese Versuche lassen keine Rückschlüsse auf den genauen Entstehungsort der Hämolyse zu und es kann nur die Blutschädigung des Gesamtsystems quantifiziert werden. Die PIV-Messung hingegen ermöglicht eine ortsaufgelöste Strömungsuntersuchung und kann mögliche Entstehungsorte für Hämolyse aufzeigen. Statt Blut wird dabei jedoch ein PIV-Fluid verwendet, welches in vielerlei Hinsicht nicht den Charakteristika von Blut entspricht.
Mit Hilfe von sogenannten Ghostcells lassen sich diese beiden Aspekte kombinieren. Ghostcells sind Erythrozyten, denen das Hämoglobin teilweise entzogen wurde. Die Form und Größe der Ghostcells ist vergleichbar zu den ursprünglichen Erythrozyten, allerdings sind die Ghostcells optisch deutlich transparenter.

Methodik

Zur Herstellung von Ghostcells werden porzine Erythrozyten vom Schlachthof in einer stark hypotonen Pufferlösung durch osmotischen Druck zur kontrollierten Lyse gebracht. Die Membran wird dabei permeabel für Ionen und größere Moleküle wie Hämoglobin, welche in das umgebende Fluid diffundieren. Die Struktur der Membran bleibt während des Prozesses intakt. Nach der Lyse wird die Membran verschlossen und die ursprüngliche Membran-Impermeabilität wiederhergestellt. Ghostcells besitzen die gleiche Form und Größe wie normale Erythrozyten, sind aber durch den niedrigeren Hämoglobingehalt transparenter für das sichtbare Licht. Abbildung 1 zeigt eine mikroskopische Aufnahme der Ghostcells unter Phasenkontrast.
Neben optischen Messungen an blutanalogen Ghostcell-Suspensionen gibt es die Möglichkeit die Ghostcells während der kontrollierten Lyse mit einem Calcium dicitrato Komplex zu beladen. Damit ist erstmals die Sichtbarmachung und räumliche Messung von Hämolyse möglich.
Im Trägerfluid außerhalb der Zellen wird ein sensitiver Fluoreszenz Calcium Indikator gelöst. Zunächst sind Indikator und Calcium durch die intakte Membran der Ghostcells getrennt. Kommt es beispielsweise zu einer mechanisch induzierten Hämolyse der Zelle, treten Indikator und Calcium in Kontakt und fluoreszieren unter Anregung einer externen Lichtquelle. Das Fluoreszenz-Signal wird von einer Kamera aufgezeichnet.
Interessant wird die Innovation der Fluorescent Hemolysis Detection (FHD)-Methode insbesondere mit einer Großmengenproduktion, die größere Mengen des Testfluides wird benötigt um Medizinprodukte zu testen. Aus dieser Motivation heraus wurde im Institut bereits ein Large Volume Batch Production System (LVBPS) realisiert, mit dem die Effizienz zur Herstellung von Ghostcells deutlich gesteigert werden konnte. Mit dem LVBPS konnte ausreichend Testflüssigkeit hergestellt werden, um einen typischen in-vitro Hämolysetest mit zwei Vergleichskreisläufen von jeweils bis zu 450 ml Blutvolumen nachzustellen. Außerdem konnte gezeigt werden, dass beladene Ghostcells in wesentlichen Eigenschaften wie Rheologie und Impermeabilität mit den Erythrozyten vergleichbar sind.

Projektziel: In-vitro-Validierung

Im Rahmen des Ghostcell Folgeprojektes soll die FHD mit PIV in-vitro kombiniert, optimiert und validiert werden, um schließlich die ortsaufgelöste Hämolysedetektion in blutführenden Medizinprodukten zu ermöglichen.
Dafür soll der Einfluss von PIV-Partikeln auf die Strömungseigenschaften einer Ghostcell Suspension überprüft werden. Weiterhin muss der Brechungsindex des Fluides für die PIV Messungen mittels Additive an den der blutführenden Komponenten angepasst werden, um eine bestmögliche optische Auflösung der Messungen zu garantieren.

Die mechanische Belastbarkeit von Ghostcells durch auftretende Scherkräfte

Zum Vergleich der mechanischen Belastbarkeit von intakten roten Blutkörperchen und Ghostcells soll eine Skala entwickelt werden, die das durch Hämolyse freigesetzte Plasmahämoglobin (fPHb) in direkten Zusammenhang zum austretenden Ca2+ aus Ghostcells in Abhängigkeit mit der Scherspannung setzt.
Zur Validierung der Messgenauigkeit von FHD wird eine Studie durchgeführt, in der die örtliche und zeitliche Auflösungsgrenze von mehreren Hämolyse-Hotspots untersucht wird. Schließlich wird, nach dem erfolgreichen Abschluss der vorangegangenen Arbeitsschritte, erstmals strömungsinduzierte, mechanische Hämolyse in einem voll funktionsfähigen Modell einer medizinischen Blutpumpe vermessen. Die daraus gewonnenen Erkenntnisse sollen den Ergebnissen der FDA-Ringstudie von Malinauskas et al. (2017) und Hariharan et al. (2018) als auch den CFD-Simulationen von Gross-Hardt et al. (2018) gegenübergestellt werden.